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BGSTAR A kit 사용설명서

투구게의 혈구추출물은 Endotoxin에 대해 고감도로 반응하여 Endotoxin 검출시약으로서 다양한 분야에서 이용하고 있습니다. 또한 투구게 혈구추출물은 Endotoxin뿐만 아니라 b-Glucan에 대해서도 고감도로 반응합니다. 본제품은 투구게 혈구추출물에서 Endotoxin 감수성 인자 및 Coagulogen을 제거하고 발색합성기질을 첨가한 주제와 표준 Curdlan 및 Diazo coupling 발색용 시약을 세트로한 b-Glucan 측정용 시약 세트입니다. 본제품은 Endotoxin 감수성 인자를 포함하지 않으므로 Endotoxin에는 감수성을 보이지 않으며 b-Glucan에 대해서만 특이적으로 반응합니다.

키트의 구성

* b-Glucan 특이검출시약 BGSTAR 주제 1vial
20테스트용 동결건조품
투구게 혈구추출물의 분획정제품과 발색합성기질을 함유

* 주제 용해용 완충액 1vial

* 표준 Curdlan 1vial
Curdlan 동결건조품
약 1,000pg(정확한 함량은 병의 라벨에 기재)의 Curdlan을 함유

* b-Glucan free water 1vial
15ml의 b-Glucan free water

* 발색시약 1
Sodium nitrite 4.8mg을 함유

* 발색시약 1 용해액
0.48N 염산 12ml를 함유

* 발색시약 2
Ammonium sulfamic acid 36mg을 함유

* 발색시약 3
N-1-Naphthylethyldiamine dihydrochloride 8.4mg을 함유

사용방법

1. 사용 기구
사용 기구중 a와 b는 b-Glucan free인 것을 사용해 주십시오.
유리기구등 내열성의 기구들은 250도로 2시간 건열멸균으로 b-Glucan free화 할 수 있습니다.
a. 메스피펫 또는 피페터 칩
b. 캡부착 시험관
c. 항온수조(37도에서 변온 상하1도 이내로 사용가능한 것)
d. 흡광광도계(액량 1.7ml로 545nm와 630nm의 2파장에서 측정이 가능한 것)

2. Curdlan 표준품 용액의 조제
a. 표준 Curdlan 병의 고무 마개의 내측에 손이 닿지 않도록 주의하면서 개봉하여 2.0ml의 b-Glucan free water를 가하고 다시 마개를 막고 약 1분간 강하게 흔들어 완전 용해시킵니다. 용해한 표준 Curdlan 용액은 빙냉시켜 주십시오.
b. a에서 조제한 용액(약 500pg/ml 용액) 0.2ml를 캡부착 시험관에 넣고 b-Glucan free water 1.8ml를 가해서 약 1분간 강하게 흔들어 약 50pg/ml의 용액을 조제합니다. 조제한 약 50pg/ml의 용액은 사용하기 전까지 빙냉시켜 주십시오.

3. 주제의 용해와 주제와 검체의 반응
a. 주제가 들어있는 병을 b-Glucan에 의한 오염에 주의하면서 천천히 개봉하고 2.2ml의 냉각한 주제 용해용 완충액을 가해서 빙냉하에 방치합니다. 몇 번 꺼내 거품이 생기지 않도록 부드럽게 흔들어 주면서 빙냉하에 10분 정도 방치하여 완전 용해 시킵니다. 용해한 주제는 사용하기 전까지 빙냉하에 방치해 주십시오.
b. 캡부착 시험관에 빙냉하에서 b-Glucan free water, 2.에서 조제한 약 50pg/ml의 표준 Curdlan 용액, 또는 검체 용액을 0.1ml씩 분주합니다.
c. 주제가 완전히 용해되어 있는 것을 확인하고 빙냉하에서 b.의 각 시험관에 주제용액 0.1ml를 첨가하여 충분히 흔들어 줍니다.
d. 바로 37도의 항온수조로 옮겨 30분간 방치합니다.

4. 발색시약 용액의 조제
30분간의 반응시간중 발색시약을 조제합니다. 발색시약 용액의 조제 이후의 조작에 있어서는 b-Glucan free의 필요는 없습니다.
a. 발색시약 1에 발색시약 1 용해액의 전량을 가해서 용해시킵니다.
b. 발색시약 2, 발색시약 3에 각각 12ml의 정제수를 가해서 용해시킵니다.

5. 반응 정지와 흡광도 측정
a. 30분 경과후 바로 빙냉하고 발색시약 1 용액 0.5ml를 가해서 충분히 흔들어 반응을 정지시킵니다.
b. 발색시약 2 용액 0.5ml를 가해 충분히 흔들어 줍니다.
c. 발색시약 3 용액 0.5ml를 가해 충분히 흔들어 줍니다.
d. 1시간 이내에 545nm와 630nm의 흡광도를 측정하고 545nm에서 630nm의 흡광도를 뺀 값(A545 - A630)을 구합니다. 이 값을 검체중의 b-Glucan 농도의 산출에 사용합니다.

6. 검체용액중의 표준 Curdlan 환산 b-Glucan 농도의 산출
약 50pg/ml의 표준 Curdlan을 주제와 반응시킨 것의 흡광도를 A std, b-Glucan free water를 주제와 반응시킨 것의 흡광도를 A blank, 검체용액과 주제를 반응시킨 것의 흡광도를 A sample, 약 50pg/ml의 표준 Curdlan 용액의 농도를 C std(pg/ml)로서 아래의 식으로 검체 용액중의 표준 Curdlan 환산 b-Glucan 농도의 C sample(pg/ml)를 산출합니다.
C sample = (A sample - A blank / A std - A blank) x C std

보관
* 2-8도씨의 암소에 보관해 주십시오.
* 용해한 주제는 가능한한 한번에 사용해 주십시오. 사용하지 않고 보존하는 경우에는 밀봉하여 -80도씨로 동결 보존하여 1개월 이내에 사용해 주십시오. 동결 용해를 반복하지 마십시오.

사용상의 주의
* 본제품의 반응 원리는 투구게의 체액응고효소를 이용한 것이므로 간혹 Protease, Protease inhibitor, EDTA등의 chelate제등에 의해 반응의 저해나 촉진이 일어날 수 있습니다.
* 표준 Curdlan 용액의 용해는 사용 직전에 행하며, 용해한 표준 Curdlan 용액은 당일중에 사용해 주십시오.
* 본제품은 시험 연구 목적이외에 사용하실 수 없습니다.